6.1.6 Приготовление градуировочных растворов

6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10  помещают по 10 мг доксициклина, окситетрациклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5  метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10  помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5  метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10  помещают 10 мг хлорамфеникола (левомицетина), взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5  метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.4 В мерную пробирку вместимостью 10  помещают по 10 мг феноксиметилпенициллина, бензилпенициллина, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5  метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по 6.1.6.1.1 - 6.1.6.1.4 составляет 1  (или 1000  ).

Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.

6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0,1  (или 100  ) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1  (6.1.6.1.5) путем его разведения метанолом в 10 раз.

Растворы хранят при температуре минус (20 2)°С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин, но не более 2 ч.

6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0,001  до 1  (для левомицетина в диапазоне от 0,00015  до 0,1  ) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по 6.1.6.1.

6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

В мерную пробирку вместимостью 10  помещают 10 мг демеклоциклина, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5  метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1  (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).

Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1  . Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Раствор хранят при температуре минус (20 2)°С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

6.2 Подготовка хроматографической системы

6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

- скорость потока элюента - 0,1  ;

- объем вводимой пробы - 20  ;

- температура хроматографирования - (30 1)°С;

- длина волны детектирования 280 нм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0% до 55% мобильной фазы Б (6.1.4.2) за 25 мин.

6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение, вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

6.3 Построение градуировочной характеристики

6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов, приготовленных по 6.1.6.2, в условиях, описанных в 6.2 и 7.

6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.

6.3.3 Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0,98.

6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

6.4 Подготовка проб продуктов

6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.

Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 2)°С, аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.

6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово-ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500 - 1000  и нагревают на водяной бане до температуры (32 2)°С, после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500  с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 2)°С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 2)°С, растирают в фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и переносят в колбу вместимостью 500  с притертой пробкой.

6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.

6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной температуре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500  до 1000  и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500  с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 2)°С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.

6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100  , расплавляют на водяной бане при температуре (60 2)°С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

6.4.8.1 В стакан вместимостью 100  помещают (5,000 0,001) г продукта, подготовленного по 6.4.2 - 6.4.6. Добавляют 20  раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) и аккуратно перемешивают. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50  , ополаскивая стакан раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки.

Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 2)°С. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.

6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50  помещают (5,000 0,001) г масла, пасты масляной, подготовленных по 6.4.7, и добавляют 35  раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 2)°С. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15  помещают (1,000 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10,0  пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0,1  раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3  ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4°С, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10  и упаривают до 1  на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 1)°С. К полученному остатку добавляют 3 - 5  буферного раствора (6.1.3), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы