В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15  помещают (1,000 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10,0  пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0,1  раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3  ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4°С, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10  и упаривают до 1  на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 1)°С. К полученному остатку добавляют 3 - 5  буферного раствора (6.1.3), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15  помещают (1,000 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10,0  пробы продукта, подготовленной по 6.4.8. Затем добавляют 3  ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4°С, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10  и упаривают до 1  на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 1)°С. К полученному остатку добавляют 3 - 5  буферного раствора (6.1.3), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.7 Проведение твердофазной экстракции

Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6  50%-ного раствора метанола и уравновешивают 6  деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по 6.5 или 6.6, и вновь промывают 6  деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6  раствора элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при температуре (40 1)°С, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2) до 0,5  , после чего используют для хроматографирования.

7 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

- температура окружающего воздуха ...................... (20 5)°С;

- относительная влажность воздуха ........................ (55 25)%;

- атмосферное давление ........................................ (96 10) кПа;

- частота переменного тока .................................... (50 5) Гц;

- напряжение в сети .............................................. (220 10) В.

8 Проведение измерений

8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.

8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по 6.7 пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в 6.2.2.

Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.

9 Обработка результатов измерений

9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрациклиновой группы, полученных с применением внутреннего стандарта

Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина

Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, m, г, вычисляют по формуле

где - масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.2 - 6.4.7, взятая для анализа и отобранная по 6.4.9, г;

- объем пробы, подготовленный по 6.4.8 и взятый для анализа (6.5 - 6.6), , ( = 10  );

- общий объем раствора, полученный при разведении пробы продукта согласно 6.4.8, , ( = 50  ).

9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X, (мг/кг), вычисляют по формуле

где С - массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, ;

- объем элюата после выпаривания по 6.7, ;

m - масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.1 и отобранная для анализа (6.5 - 6.6) или определенная по формуле (1), г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух последовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1, пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по 10.1.

9.5 Контроль точности результатов измерений

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при Р = 0,95 приведены в таблице 1.

Диапазон измерений массовой доли антибиотиков, (мг/кг)	Предел повторяемости , %	Предел воспроизводимости , %	Границы относительной погрешности, , %
От 0,0001 до 0,001 включ.	70	85	60
Св. 0,001 до 0,010 включ.	50	57	40
Св. 0,010 до 0.100 включ.	25	37	26
Св. 0,100 до 1.000 включ.	20	28	20

10 Проверка приемлемости результатов измерений

10.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости (два последовательных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

где , - значения результатов двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости, (мг/кг);

- среднеарифметическое значение двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, (мг/кг);

- предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в таблице 1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).