8.1 Подготовка посуды

Стеклянную химическую посуду, используемую в процессе анализа, ополаскивают водопроводной водой, запивают хромовой смесью до 1/4 - 1/3 вместимости сосуда и осторожно смачивают внутренние его стенки. После этого хромовую смесь выливают обратно в емкость для хранения. Посуду оставляют на несколько минут, затем тщательно отмывают сначала водопроводной, а затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105°С.

8.2 Подготовка реактивов и материалов, приготовление растворов

8.2.1 Натрий сернокислый безводный прокаливают в муфельной печи 4 ч при температуре 400°С и охлаждают в эксикаторе.

Срок хранения натрия сернокислого безводного в эксикаторе при комнатной температуре - не более 3 мес.

8.2.2 Осадительный реактив

В химическом стакане вместимостью 500  взвешивают (70,0 0,1) г сернокислой меди и растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000  и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

Срок хранения осадительного реактива в склянке из темного стекла при комнатной температуре - не более 3 мес.

8.2.3 Раствор гидроксида калия в метаноле молярной концентрации 2

В мерной колбе вместимостью 100  взвешивают (11,21 0,01) г предварительно измельченного гидроксида калия и доводят объем раствора до метки метанолом, интенсивно перемешивают до полного растворения гидроксида калия и дают остыть до комнатной температуры.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре (4 2)°С - не более 3 мес.

8.2.4 Стандартный раствор холестерина массовой концентрации 5 

В химическом стакане вместимостью 100  взвешивают (0,50 0,01) г холестерина, вносят около 50  н-гексана, аккуратно перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100  и доводят объем раствора н-гексаном до метки.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре (4 2)°С - не более 6 мес.

8.2.5 Раствор смеси фитостеринов суммарной концентрации 5 

В мерную колбу вместимостью 5  вносят 1  раствора смеси фитостеринов, доводят объем раствора до метки н-гексаном и перемешивают.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре (4 2)°С - не более 6 мес.

8.2.6 Рабочий раствор смеси холестерина и фитостеринов массовой концентрации холестерина 2,5  и фитостеринов (суммарно) 2,5 

В стеклянную виалу вместимостью 2  вносят 0,5  раствора смеси фитостеринов, приготовленного по 8.2.5, и 0,5  раствора холестерина, приготовленного по 8.2.4, и тщательно перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа.

8.3 Подготовка хромато-масс-спектрометра

Хромато-масс-спектрометр для анализа в режиме ионизации пробы электронным ударом готовят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и устанавливают режим для анализа.

Примерный вид режима приведен ниже:

а) режим хроматографирования:

инжектируемый объем анализируемой пробы - 1  ;

деление потока - 1 : 1;

температура испарителя - 310°С;

время задержки включения детектора - 28 мин;

тип колонки - HP-5MS;

газ-носитель - гелий;

скорость потока гелия через колонку - 1  ;

программирование температуры термостата:

- начальная температура колонки - 115°С, время анализа при этой температуре - 1 мин;

- скорость нагрева колонки от 9°С/мин до 260°С, от 3°С/мин до 290°С;

б) режим масс-спектрометра:

энергия ионизации - 70 эВ;

температура ионного источника - 230°С;

температура квадруполя - 150°С;

температура ГХ/МС интерфейса - 290°С;

диапазон сканирования масс ионов: 35 - 450 а.е.м.

При соблюдении вышеуказанных условий продолжительность анализа составляет 45 мин.

8.4 Градуировка хроматографа

Градуировка хроматографа заключается в определении времени удерживания анализируемых стеринов (приложение А) и выполняется путем анализа рабочего раствора смеси холестерина и фитостеринов по 8.2.6 в условиях, приведенных в 8.3. Масс-спектрометрический анализ проводят в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) характеристических ионов стеринов. Значения масс характеристических ионов приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Значения масс характеристических конов холестерина и фитостеринов

Наименование	Характеристические ионы, а.е.м.
	целевой	подтверждающие
Холестерин	386	275; 301
Брассикастерин	398	255; 300
Кампестерин	400	43; 81
Стигмастерин	412	55; 83
-ситостерин	414	329; 145

При наличии плохо разделенных хроматографических пиков стеринов корректируют режим хроматографирования.

Критерии приемлемости результатов анализа и проверки работоспособности хроматографической системы заключаются в следующем:

Хроматографическая система считается работоспособной, если выполняются следующие условия:

- разрешение между пиками стеринов на хроматограмме рабочего раствора не менее 1,5;

- асимметрия пиков на хроматограмме рабочего раствора не более 1,5;