Б.1 Сущность метода

Метод основан на просмотре микробиологических препаратов под микроскопом и прямом подсчете клеток микроорганизмов в единице объема пробы. Прямое микроскопирование препаратов позволяет обнаружить винные дрожжи и установить их количество.

Б.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Микроскоп световой биологический любого типа, обеспечивающий увеличение 900-1000^х.

Счетная камера*, представляющая собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками на части. Центральная часть стекла ниже боковых на 0,1 мм, на нее нанесена сетка. Площадь сетки равна 9 мм². На предметном стекле имеются две такие сетки, разделенные центральной полосой. Сетка разделена на 225 больших квадратов, 15 рядов по 15 квадратов в каждом. Каждый третий ряд в вертикальном и горизонтальном направлениях разделен на маленькие квадраты.

──────────────────────────────

* Например, камера Горяева. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других камер с аналогичными техническими характеристиками.

Стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672.

Палочки стеклянные.

Петли бактериологические.

Кислота серная по ГОСТ 4204.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Спиртовка.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования, материалов и реактивов, по техническим характеристикам и качеству не уступающих указанным выше.

Б.3 Отбор и подготовка проб

Б.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 31730 (с соблюдением правил стерильности) и ГОСТ 31904 со следующим дополнением.

Готовую продукцию отбирают с линии розлива в количестве трех бутылок; при стерильном розливе - в количестве шести бутылок, по две бутылки в начале, середине и конце розлива.

Б.3.2 Подготовка проб - по ГОСТ 26669.

Б.4 Условия проведения определения

Микробиологические работы проводят в асептических условиях по ГОСТ ISO 7218.

Б.5 Требования безопасности - по ГОСТ ISO 7218.

Б.6 Подготовка к проведению определения

Перед взятием пробы готового напитка пробку и горловину бутылки протирают ватным тампоном, смоченным в 70-процентном растворе этилового спирта по ГОСТ 5962. Затем быстро снимают пробку бутылки. Горловину открытой бутылки обжигают в пламени спиртовки или протирают 70-процентным раствором этилового спирта по ГОСТ 5962 и отбирают необходимый для анализа объем напитка.

Не допускается обжигать над пламенем стеклянную бутылку с газированным напитком, закупоренную кроненпробкой.

Непосредственно перед вскрытием упаковку с продуктом перемешивают многократным переворачиванием.

Б.7 Проведение определения

Б.7.1 При определении общего содержания винных дрожжей в 1 см³ и прямого их подсчета используют счетную камеру.

Б.7.2 Для прямого микроскопирования готовят препарат "раздавленная капля". Каплю исследуемой пробы после тщательного взбалтывания не менее 1 мин. сухой стерильной стеклянной палочкой или бактериологической петлей наносят на сетку счетной камеры и покрывают шлифованным специальным покровным стеклом размером 18 x 18, толщиной (0,30   0,05) мм. Можно использовать покровные стекла размером 24 х 24 толщиной (1,16   0,01) мм, при необходимости разводят пробу, так как в одном большом квадрате число клеток микроорганизмов не должно превышать 60-80, а в пяти квадратах - 600. Жидкость должна равномерно распределяться по поверхности сетки, без пузырьков. Покровное стекло прижимают большими пальцами к боковым площадкам счетной камеры и притирают до появления радужных (Ньютоновских) колец. При необходимости избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.

Подсчет клеток начинают через 3-5 мин. после заполнения счетной камеры, для того чтобы клетки осели и были видны под микроскопом в одной плоскости. Счетную камеру кладут на столик микроскопа и находят в поле зрения сетку. Подсчет ведут в пяти больших квадратах, расположенных по диагонали или по углам и в центре сетки. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата, если наполовину или большей своей частью они расположены внутри квадрата. Клетки, большая часть которых находится в другом квадрате, не подсчитываются. Точность определения зависит от того, насколько плотно покровное стекло притерто к поверхности камеры, поэтому подсчет проводят несколько раз. Например, подсчитывая четыре раза, каждый раз - по 150-200 клеток в пяти больших квадратах. Общее число подсчитанных клеток должно быть не менее 600.

Б.7.3 При подсчете клеток винных культур дрожжей, образующих конгломераты, необходимо к исследуемой суспензии перед заполнением камеры добавлять равное количество раствора серной кислоты с массовой концентрацией 100 г/дм³ и встряхивать не менее 5 мин. для разъединения скоплений клеток. При подсчете числа микроорганизмов в 1 см³ следует учитывать разбавление раствором серной кислоты.

Б.8 Обработка результатов

Подсчет проводят не менее чем в двух повторностях, заполняя и подсчитывая две сетки, и находят среднеарифметическое значение результатов в пяти больших квадратах.

Объем одного большого квадрата в счетной камере равен 1/250 мм³, соответственно объем пяти квадратов равен 5/250, или 1/50 мм³. Чтобы определить количество клеток в 1 см³ (в 1000 мм³) исследуемой пробы, нужно среднюю сумму количества клеток в пяти больших квадратах умножить на 50 000. Число микроорганизмов в 1 см³ пробы вычисляют по формуле

где M - число микроорганизмов в суспензии, млн клеток/см³;

50 000 - коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 см³;

a - общее число подсчитанных клеток в пяти больших квадратах;

n - кратность разведения.

Библиография

[1]	TP ТС 021/2011	Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции"
[2]	TP ТС 029/2012	Технический регламент Таможенного союза "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств"
[3]	TP ТС 005/2011	Технический регламент Таможенного союза "О безопасности упаковки"
[4]	TP ТС 022/2011	Технический регламент Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки"