Действующий
3.5.2 Данный метод применим для чистых веществ, которые не диссоциируют или ассоциируют, и которые не проявляют значительной активности на поверхности раздела фаз. Он может применяться для определения коэффициента разделения н-октанол/вода для подобных веществ и смесей. Когда метод используется для смесей, коэффициент распределения н-октанол/вода определяется условно и зависит от химического состава тестируемой смеси, а состав электролита используется в качестве водной фазы. При условии, что будут предприняты дополнительные меры, данный метод может быть применен к диссоциируемым или ассоциируемым соединениям (см. 3.5.3).
3.5.3 Из-за многократного повторения условий фазового равновесия в воде и н-октаноле, участвующего в разделении диссоциирующих веществ, таких как органические кислоты и фенолы, органические основания, и металлоорганические вещества, коэффициент распределения является условно постоянной величиной и сильно зависит от состава электролита. Поэтому определение коэффициента распределения н-октанол/вода требует, чтобы рН и электролитный состав контролировались при проведении экспериментов и приводился в отчетности. Для оценки этого отношения должна использоваться экспертная оценка. Используя значение константы диссоциации, должны быть выбраны соответствующие значения рН таким образом, чтобы отношение разделения определялось для каждого ионизированного состояния. Для тестирования металлоорганических соединений должны использоваться некомплексообразующие буферы. Принимая во внимание существующие знания в области химии растворов (константа комплексообразования, константа диссоциации), экспериментальные условия должны выбираться таким образом, чтобы состав тестируемого вещества в водной фазе можно было бы оценить. С помощью использования фонового электролита, ионная сила должна быть одинакова во всех экспериментах.
3.5.4 Сложности тестирования могут возрастать при проведении тестирования веществ с низким показателем растворимости или высоким показателем из-за того, что концентрации в воде становятся очень низкими, в связи с чем их точное определение затрудняется. В настоящем стандарте приводится руководство, как решить эту проблему.
3.6.1 Используемые в опыте химические реактивы должны быть степени ч.д.а. или высокой степени чистоты. Предпочтительно использование не меченых радиоактивным изотопом химических веществ с известным химическим составом по крайней мере 99% чистоты или рекомендовано использование меченых веществ с известным составом радиохимической чистоты. В случае использования элементов с малым периодом полураспада, необходимо учитывать поправку на затухание. В случае меченого радиоактивным изотопом тестируемого вещества, должны использоваться специальные химические аналитические методы для гарантии того, что измерения радиоактивности относятся непосредственно к тестируемому веществу.
3.6.2 Оценка может быть получена путем использования промышленно доступного оборудования для оценки или путем использования соотношения растворимостей в обоих растворителях.
3.6.3 Перед проведением эксперимента методом медленного перемешивания, необходимо знать следующую информацию о тестируемом веществе:
- аналитические контрольно-измерительные приборы, подходящие для определения концентрации тестируемого вещества в ожидаемых концентрациях;
- сосуд для перемешивания с краном в нижней части. В зависимости от оценки и расчетного нижнего предела чувствительности тестируемого соединения, должно быть учтено использование реакционного сосуда подобной конфигурации больше, чем на один литр; таким образом может быть получен достаточный объем воды для химической экстракции и анализов. Это приведет к повышению концентрации в водной вытяжке и, следовательно, более надежному аналитическому определению. В приложении А приведена таблица А.1, содержащая оценку минимально необходимого объема, нижнего предела чувствительности соединения, его оценочный показатель и его растворимость в воде. Таблица А.1 основывается на взаимосвязи между и отношением между растворимостью в октаноле (
) и воде (
), как показано в (2),
) и воде ( ), как показано в (2),
, (2)
, в молярных концентрациях;Растворимость в воде, рассчитываемая по формуле А.2, приведенной в приложении А, должна рассматриваться в качестве первоначальной оценки. Следует отметить, что пользователь может производить оценку растворимости в воде при помощи каких-либо отношений, которые лучше представлять в виде отношений между гидрофобностью и растворимостью. Например, для твердых соединений рекомендуется включение температуры плавления в предварительную оценку растворимости. В случае использования модифицированного уравнения, необходимо удостовериться, что уравнение для расчета растворимости в октаноле применимо. Схематичное изображение сосуда для перемешивания со стеклянной оболочкой объемом приблизительно один литр представлено в приложении В на рисунке В.1. Пропорции сосуда, показанного в приложении В, признаны подходящими и должны быть сохранены в том случае, если используется аппарат другого размера.
4.1.2 Сосуды должны быть сделаны из инертных материалов так, чтобы можно было пренебречь величиной адсорбции на поверхностях сосуда.
4.2.1 Определение должно проводиться с использованием н-октанола высокой степени чистоты, доступного для приобретения (по крайней мере +99%). Рекомендуется очистка н-октанола путем экстракции кислотой, основанием водой, а также последующая сушка. Кроме того, для очистки н-октанола может использоваться дистилляция. Очищенный н-октанол будет использоваться для подготовки стандартных растворов тестируемых веществ. Вода, используемая в эксперименте, должна быть дистиллированной в стеклянном или кварцевом сосуде, либо получена из системы очистки или водой квалификации "для ВЭЖХ". Для дистиллированной воды требуется фильтрация через фильтр 0,22 мкм и должна измеряться холостая проба для проверки отсутствия в концентрированных экстрактах примесей, которые могут повлиять на тестируемое вещество. Если используется фильтр из стекловолокна, то он должен быть очищен путем обжига, при температуре 400 °С по крайней мере в течение трех часов.
4.2.2 До проведения эксперимента оба растворителя взаимно насыщаются путем уравновешивания их в достаточно большом сосуде. Этого достигают путем медленного перемешивания в двухфазной системе в течение двух дней.
4.2.3 Выбирается соответствующая концентрация тестируемого вещества и растворяется в н-октаноле (насыщенного водой). должен быть определен в разбавленных растворах в н-октанола и воды. Поэтому концентрация тестируемого вещества не должна превышать 70% его растворимости с максимальной концентрацией 0,1 М в каждой фазе. Растворы н-октанола, используемые для эксперимента, не должны иметь твердых частиц тестируемого вещества.
4.2.4 Соответствующее количество тестируемого вещества растворяется в н-октаноле (насыщенном водой). Если оценочное значение более пяти, необходимо принять во внимание, что растворы н-октанола, используемые для эксперимента, очищаются от твердых частиц тестируемого вещества. В связи с этим, ниже приведена процедура для испытания химических веществ с оценочным значением более пяти:
- этот раствор отстаивается достаточное количество времени до осаждения твердых частиц вещества. Во время отстаивания проверяется концентрация тестируемого вещества;
- после того, как измеренные концентрации в н-октаноле достигли устойчивых значений, основной раствор (маточный раствор) разводится соответствующим объемом н-октанола;
- измеряется концентрация разбавленного основного раствора. Если значение концентрации соответствует разбавлению, то основной раствор может использоваться в методе медленного перемешивания.
4.3.1 Для анализа тестируемого вещества должны использоваться признанные аналитические методы. Исследователи должны предоставлять доказательства того, что концентрации в воде, насыщенной н-октанолом, так же, как и октанол, насыщенный водной фазой, во время эксперимента выше границы предела количественного определения аналитического метода. В тех случаях, когда требуются методы экстракции, перед проведением эксперимента необходимо организовать аналитическое извлечение тестируемого вещества из водной фазы и из н-октанола. Необходимо скорректировать аналитический сигнал холостой пробы и принять во внимание, что может произойти перенос исследуемого вещества из одного образца в другой.
4.3.2 Скорее всего, из-за довольно низкой концентрации гидрофобных тестируемых веществ в водной фазе, будут необходимы предварительный анализ экстракции водной фазы органическим растворителем и предварительное концентрирование экстракта. По этой же причине необходимо уменьшить последующие концентрации холостых проб. Для этого необходимо в работе использовать растворители высокой чистоты, предпочтительно растворителей для анализа остатков. Кроме того, работа с тщательно предварительно очищенной стеклотарой (например, промывка растворителем или обжиг при повышенной температуре) может помочь избежать перекрестного загрязнения.
4.3.3 Оценочное значение может быть получено из оценочных программ или путем экспертной оценки. Если значение выше, чем шесть, то необходимо тщательно следить за исправлениями холостой пробы и переносом исследуемого вещества. Аналогичным образом, если оценочное значение выше шести, то обязательно использование стандарта-имитатора для поправочной коррекции, поэтому высокие факторы переконцентрации могут быть достигнуты. В настоящее время доступен ряд коммерческого программного обеспечения для оценки , например, Clog Р, KOWWIN, ProLogP и ACD logP.
4.3.4 Чувствительность метода для определения тестируемого вещества в н-октаноле и воде устанавливается с помощью общепринятых методов. Уровень чувствительности метода может быть определен, как концентрация в воде или н-октаноле, которая производит отношение сигнала к помехе в размере десяти. Должны быть выбраны соответствующая экстракция и метод предварительного концентрирования, а также определена аналитическая степень извлечения. Соответствующий фактор предварительной концентрации выбирается для получения сигнала требуемого размера на основании аналитического определения.
4.3.5 На основе параметров аналитического метода и ожидаемых концентраций определяется приблизительный размер требуемого образца для точного определения концентрации соединения. Следует избегать использования проб воды, которые слишком малы, чтобы получить достаточный аналитический сигнал. Также следует избегать использования чрезмерно больших проб воды, так как иначе может остаться слишком мало воды для минимального количества необходимых анализов (
5). В приложении А приведен уровень обнаружения тестируемого вещества и растворимость тестируемого вещества в зависимости от минимального объема образца и объема сосуда.
5). В приложении А приведен уровень обнаружения тестируемого вещества и растворимость тестируемого вещества в зависимости от минимального объема образца и объема сосуда.4.3.6 Количественная оценка тестируемого вещества проводится путем сравнения калибровочных графиков соответствующих соединений. Концентрации в анализируемых образцах должны быть заключены в квадратные скобки согласно стандартам концентрации.
4.3.7 Для тестируемых веществ с оценочным значением более шести, перед проведением экстракции должен быть установлен стандарт-имитатор с добавлением известного количества определяемого вещества в образец воды для того, чтобы регистрировать потери по время экстракции и предконцентрации образцов воды. Для точной поправки на извлечение, имитаторы должны иметь свойства очень близкие или идентичные тестируемому веществу. Предпочтительно (постоянно) использование изотопно меченых аналогов интересуемого вещества (например, пердейтерированных или 13С-меченых). Если использование меченых стабильных изотопов, т.е., 13С или 2Н, не представляется возможным, то необходимо показать из надежных источников литературы, что физико-химические свойства имитаторов очень близки к тестируемому веществу. Во время жидкость-жидкостой экстракции водной фазы могут образовываться эмульсии. Их образование может быть снижено путем добавления соли и отстаиванием эмульсии накануне. Необходимо сообщать методы, используемые для выделения и преконцентрации образцов.
4.3.8 Перед анализом образцы, извлеченные из фазы н-октанола, при необходимости могут быть разбавлены соответствующим растворителем. Кроме того, рекомендуется использование стандартов-имитаторов для поправочной корректировки для веществ, для которых эксперимент извлечения демонстрирует высокую степень различных вариаций в экспериментах извлечениях (относительное стандартное отклонение более 10%).
4.3.9. Необходимо сообщать подробную информацию об аналитическом методе. Он включает в себя метод экстракции, преконцентрацию и коэффициент разбавления, параметры прибора, процедуру проверки, диапазон калибровки, поправочную корректировку тестируемого вещества из воды, и помимо суррогатных стандартов для поправочной коррекции - значения холостой пробы, пределы обнаружения и предел количественного определения.
4.4.1.1 При выборе объемов воды и н-октанола должен приниматься во внимание предел количественного определения в н-октаноле и воде, фактор предконцентрации, используемый для образцов воды, объемы образцов в н-октаноле и воде, и ожидаемые концентрации. В результате экспериментов объем н-октанола в методе медленного перемешивания должен выбираться так, чтобы слой н-октанола был достаточно толстым (более 0,5 см) для того, чтобы допустить испытание фазы н-октанола без её нарушения.