4.1.1. Подготовка пластинок для хроматографического анализа.

Пластинку "Силуфол" размером 15x15 см помещают в камеру для хроматографии, в которую предварительно наливают смесь бензол-этилацетат-уксусная кислота(100:50:1) (система 1). Развитие хроматограммы проводят до достижения растворителем верхнего края пластинки. Затем пластинку извлекают из камеры, сушат 10 мин на воздухе, помещают в сушильный шкаф и активируют при 110-120°С в течение часа. Для анализа требуется несколько пластинок, которые после активирования до использования хранят в закрытом эксикаторе над хлористым кальцием.

4.1.2. Проведение тонкослойной хроматографии, идентификация НА и количественное определение.

На расстоянии 3 см от нижнего края пластинки проводят карандашом тонкую горизонтальную линию, на которую с интервалом в 1,3 см наносят 10 точек. В первую точку наносят 10-20 мкл исследуемого раствора А, во вторую - 10-20 мкл раствора Б, в последующие 6 точек - по 1 мкл каждого стандартного раствора КАЭ-производных с концентрацией , а в 9 и 10 точки наносят по 4 мкл растворов и .

При определении содержания НА в солоде и пиве в 9 и 10 точки наносят соответственно 1 и 3 мкл раствора . Пластинку поворачивают на 180° и помещают в хроматографическую камеру с системой 1. Развитие хроматограммы проводят до достижения верхнего края пластинки. Пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе 15 мин, срезают 2 см ниже фронта, тем самым удаляя избыток реагента и липофильные примеси, переворачивают на 180° и помещают в хроматографическую камеру со смесью ацетонитрил - 25%-ный аммиак (9:1) (система 2). Уровень растворителя должен быть примерно на 1 см ниже нанесенных пятен. Развитие хроматограммы проводят до достижения растворителем верхнего края пластинки. Пластинку сушат на воздухе и вновь помещают в хроматографическую камеру с системой 1. Хроматографируют в том же направлении, сушат и рассматривают в УФ-свете (лампа ОЛД-41 или прибор для флуоресцентного анализа витаминов, модель 833). Сравнивая подвижность флуоресцирующих производных, которые обнаружены в образце, с подвижностью соответствующих КАЭ-производных стандартов, осуществляют идентификацию НА.

Сравнивая интенсивность флуоресценции различных количеств стандартных НА с интенсивностью флуоресценции образца и "холостого опыта", определяют количество НА в пробе. При этом содержание НА в пробе рассчитывают по следующей формуле:

где K - количество НА в продовольственном сырье или пищевом продукте, мкг/кг,

N - количество НА в пробе с учетом "холостого опыта", мкг,

П - навеска продукта, кг,

- объем анализируемой пробы, мкл,

- объем нанесенной пробы, мкл,

1,2 - коэффициент, характеризующий степень денитрозирования НА, выход на стадии получения флуоресцентного производного, а также полноту извлечения НА.

При необходимости количественное определение содержания НА в продовольственном сырье и пищевых продуктах проводят на флуориметре. На двух или более пластинках (в зависимости от вязкости анализируемого раствора) на расстоянии 3 см от нижнего края пластинки наносят полосой в 6-7 см весь (100 мкл) анализируемый раствор и на тех же пластинках полосой в 3-4 см наносят по 100 мкл растворов стандартов с концентрацией, которая обнаружена в пробе. Аналогично наносят пробы "холостого опыта". Хроматографируют как описано выше, п. 4.1.2. Пластинки высушивают на воздухе, рассматривают в УФ-свете, отмечают иглой или карандашом флуоресцирующие зоны исследуемого раствора и стандартов, объединяют их вместе с каждой пластинки, разрезают на мелкие кусочки, помещают в колбочки на 10 мл, заливают 4 мл 1 и раствора НСl и, периодически встряхивая, выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор осторожно сливают в чистые колбочки (если попадают частицы силикагеля, пробы фильтруют), ополаскивают силикагель 3 раза по 1 мл 1 н НСl, и промывные воды объединяют с основным раствором. Аналогично поступают с каждой флуоресцирующей зоной образца, стандартов и "холостого опыта".

Величину флуоресценции полученных растворов (по 7 мл каждого) измеряют на электронном флуориметре ЭФ-ЗМ (прибор для определения витаминов) со светофильтрами: первичный - - 1, вторичный - - 2. Количество НА в образце рассчитывают по формуле:

где K - количество соответствующего НА в продовольственном сырье или пищевом продукте, мкг/кг

П - количество НА стандарта, мкг,

М - навеска продукта, кг,

- флуоресценция НА образца за вычетом флуоресценции "холостого опыта",

- флуоресценция соответствующего НА стандарта,

1,2 - коэффициент, характеризующий полноту извлечения НА, степень денитрозирования и выход на стадии получения флуоресцентного производного.

Статистическая обработка результатов анализа продовольственного сырья и пищевых продуктов показала, что относительное, стандартное отклонение колеблется от 0,2 до 0,3 (при п = 6, Р = 0,90).

1674 × 1040 пикс.     Открыть в новом окне

Главный государственный санитарный врач СССР

П.Н. Бургасов