Действующий
.
Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют получаемые окраски и величины экстинкции откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина Д - по оси абсцисс.
на графике получается прямая линия.
Навеску концентрата, в количестве 0,5-2 г, в зависимости от содержания витамина Д, взятую на аналитических весах, помещают в колбу, снабженную обратным холодильником, и подвергают омылению на водяной бане при помощи 10 
10%-ного спиртового раствора КОН в течение 1 ч при температуре кипения спирта.
10%-ного спиртового раствора КОН в течение 1 ч при температуре кипения спирта.
По охлаждении смеси к ней добавляют двойной объем дистиллированной воды, переносят в делительную воронку, смывают из колбы небольшими порциями воды и неомыляемую фракцию извлекают трижды серным эфиром, свободным от перекиси, используя первый раз 50 
, второй и третий раз по 25 
эфира.
, второй и третий раз по 25 эфира.
Объединенные эфирные вытяжки тщательно промывают водой до полного удаления щелочи (проба на лакмусовую бумагу или фенолфталеин), отделяют водный слой, к эфирному экстракту добавляют 5-7 г свежепрокаленного сернокислого натрия и взбалтыванием колбы с содержимым высушивают вытяжку до полной прозрачности (в течение 15-20 мин).
Эфирную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр; колбу и фильтр ополаскивают небольшим количеством эфира, сливая последний через тот же фильтр, и отгоняют эфир на водяной бане в токе углекислого газа или азота до получения сухого остатка. Остаток растворяют в чистом сухом хлороформе в мерной колбе подходящего объема с таким расчетом, чтобы в 1 
раствора содержалось не менее 200 и не более 1000 ин. ед. витамина Д..
раствора содержалось не менее 200 и не более 1000 ин. ед. витамина Д..
Из полученного раствора отбирают точно 1 
в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 
хлороформенного раствора треххлористой сурьми (отношение 1:6) и точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся окраски с указанным выше светофильтром.
в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьми (отношение 1:6) и точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся окраски с указанным выше светофильтром.
В,качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 
хлороформа, 6 
раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.
хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.
концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле
,
раствора, ин. ед.;
;
При определении витамина Д в масляных растворах с содержанием до 10000 ин. ед. в 1 
надо вносить поправку на вещества, содержащиеся в неомыляемой фракции рафинированного подсолнечного масла, дающие такую же, как витамин Д, окраску с треххлористой сурьмой. При вычислении содержания витамина Д в вышеуказанных масляных растворах уменьшают полученные данные на 25%.
надо вносить поправку на вещества, содержащиеся в неомыляемой фракции рафинированного подсолнечного масла, дающие такую же, как витамин Д, окраску с треххлористой сурьмой. При вычислении содержания витамина Д в вышеуказанных масляных растворах уменьшают полученные данные на 25%.
Высокоактивные спиртовые концентраты предварительно разбавляют спиртом с таким расчетом, чтобы в 1 
содержалось не более 10000 ин. ед. витамина Д. Из разбавленного спиртового раствора отбирают пипеткой 1 
помещают в небольшую колбу Вюрца и отгоняют растворитель на водяной бане досуха в токе углекислого газа или азота.
содержалось не более 10000 ин. ед. витамина Д. Из разбавленного спиртового раствора отбирают пипеткой 1 помещают в небольшую колбу Вюрца и отгоняют растворитель на водяной бане досуха в токе углекислого газа или азота.
Полученный остаток растворяют в хлороформе и переносят в мерную колбу такого объема, чтобы в 1 
раствора содержалось от 200 до 1000 ин. ед. витамина Д.
раствора содержалось от 200 до 1000 ин. ед. витамина Д.
Из полученного раствора отбирают 1 
, помещают в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 
хлороформенного раствора треххлористой сурьмы. Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся, окраски с указанным выше светофильтром.
, помещают в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьмы. Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся, окраски с указанным выше светофильтром.
В качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 
хлороформа, 6 
раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.
хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.
концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле.
,
раствора, ин. ед.;
;
.
а) Тиаминхлорид-гидрохлорид 100%-ной чистоты с температурой плавления 246 - 250°С. Если нужно, его перекристаллизовывают 2 раза из 80%-ного этилового спирта, высушивают в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и хранят в эксикаторе, в темноте.
б) Красная кровяная соль. После перекристаллизации из дистиллированной воды из нее перед анализом приготовляют 1%-ный водный раствор.
г) Окислительная смесь: перед анализом смешивают 4 
1%-ного раствора красной кровяной соли с 96 
15%-ного раствора едкого натра.
1%-ного раствора красной кровяной соли с 96 15%-ного раствора едкого натра.
д) Изобутиловый спирт с температурой кипения 107-108°С, изоамиловый спирт с температурой кипения 130°С или бутиловый-спирт с температурой кипения 117°С (употребляется любой из указанных спиртов).
Примечание. В случае наличия флуоресценции спирты перед употреблением подвергают очистке: к 1 
спирта прибавляют 15-20 г активированного угля, встряхивают 15 мин, оставляют на сутки, повторяя несколько раз встряхивание. Декантируют, фильтруют, высушивают над хлористым кальцием и перегоняют при соответствующей температуре (перегонку изобутилового, изоамилового и бутилового спирта ведут на глицериновой или песчаной бане, а этилового - на водяной бане).
спирта прибавляют 15-20 г активированного угля, встряхивают 15 мин, оставляют на сутки, повторяя несколько раз встряхивание. Декантируют, фильтруют, высушивают над хлористым кальцием и перегоняют при соответствующей температуре (перегонку изобутилового, изоамилового и бутилового спирта ведут на глицериновой или песчаной бане, а этилового - на водяной бане).
Все применяемые реактивы должны соответствовать требованиям действующих стандартов или технических условий.
Флуороскоп: ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4, помещенная в кожух с черным никелевым светофильтром с набором пробирок одинакового диаметра из однородного нефлуоресцирующего стекла.
100 мг чистого кристаллического тиаминхлорида-гидрохлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе, вместимостью 1 
. Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой на холоду не более 1 мес. Из этого раствора приготовляют путем разведения стандартные рабочие растворы в мерных колбах вместимостью 100 
по табл. 3.
. Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой на холоду не более 1 мес. Из этого раствора приготовляют путем разведения стандартные рабочие растворы в мерных колбах вместимостью 100 по табл. 3.Номер стандартного раствора | Количество основного раствора,  | Количество добавленной воды,  | Содержание витамина  (тиаминхлорид-гидрохлорида) в 1  полученного стандартного раствора,  |
1 | 0,1 | до 100 | 0,1 |
2 | 0,2 | " 100 | 0,2 |
3 | 0,3 | " 100 | 0,3 |
4 | 0,4 | " 100 | 0,4 |
5 | 0,5 | " 100 | 0,5 |
6 | 0,6 | " 100 | 0,6 |
7 | 0,7 | " 100 | 0,7 |
8 | 0,8 | " 100 | 0,8 |
9 | 0,9 | " 100 | 0,9 |
10 | 1,0 | " 100 | 1,0 |
11 | 1,2 | " 100 | 1,2 |
12 | 1,4 | " 100 | 1,4 |
13 | 1,6 | " 100 | 1,6 |
14 | 1,8 | " 100 | 1,8 |
15 | 2,0 | " 100 | 2,0 |
Из каждого рабочего стандартного раствора отбирают по 1 
в капельные или делительные воронки вместимостью 50 
или в цилиндры с притертой пробкой и добавляют при помощи градуированных пипеток по 4 
дистиллированной воды, по 3 
окислительной смеси, сильно встряхивают, прибавляют 12 
изобутилового или другого рекомендованного спирта из бюретки и встряхивают в течение 2 мин. После разделения водной и спиртовой фаз водную нижнюю фазу удаляют, а в спиртовую фазу добавляют около 0,5 г сернокислого натрия или 2 
этилового спирта. После перемешивания и отстаивания отбирают 10 
этого раствора и переносят в пробирку для последующего определения флуоресценции. Пробирку закрывают корковой пробкой и сохраняют в темноте.
в капельные или делительные воронки вместимостью 50 или в цилиндры с притертой пробкой и добавляют при помощи градуированных пипеток по 4 дистиллированной воды, по 3 окислительной смеси, сильно встряхивают, прибавляют 12 изобутилового или другого рекомендованного спирта из бюретки и встряхивают в течение 2 мин. После разделения водной и спиртовой фаз водную нижнюю фазу удаляют, а в спиртовую фазу добавляют около 0,5 г сернокислого натрия или 2 этилового спирта. После перемешивания и отстаивания отбирают 10 этого раствора и переносят в пробирку для последующего определения флуоресценции. Пробирку закрывают корковой пробкой и сохраняют в темноте.