21. Составление калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой применяют чистый, кристаллический кальциферол, растворенный в хлороформе, содержащий 10000 ин. ед. витамина Д в 10 (1 ин. ед. витамина Д соответствует 0,025 г чистого кальциферола). Хлороформенный раствор витамина Д хранится не более одного дня.

Измерение интенсивности окраски хлороформенного раствора кристаллического кальциферола с треххлористой сурьмой проводят в электрофотоколориметре со светофильтром 480-530 или штуфенфотометре.

Для проведения электрофотоколориметра к нулю пользуются хлороформенным раствором треххлористой сурьмы. Для получения точек калибровочной кривой берут 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 стандартного раствора витамина Д, доводят хлороформом до объема 1 , добавляют по 3 капли ацетилхлорида и 6 раствора треххлористой сурьмы. Отношение испытуемого раствора к раствору треххлористой сурьмы составляет 1:6.

Общий объем реакционной смеси должен составлять 7 .

Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют получаемые окраски и величины экстинкции откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина Д - по оси абсцисс.

В пределах содержания витамина Д от 200 до 1000 ин. ед. в 1 на графике получается прямая линия.

22. Определение витамина Д в масляных концентратах с омылением

Навеску концентрата, в количестве 0,5-2 г, в зависимости от содержания витамина Д, взятую на аналитических весах, помещают в колбу, снабженную обратным холодильником, и подвергают омылению на водяной бане при помощи 10 10%-ного спиртового раствора КОН в течение 1 ч при температуре кипения спирта.

По охлаждении смеси к ней добавляют двойной объем дистиллированной воды, переносят в делительную воронку, смывают из колбы небольшими порциями воды и неомыляемую фракцию извлекают трижды серным эфиром, свободным от перекиси, используя первый раз 50 , второй и третий раз по 25 эфира.

Объединенные эфирные вытяжки тщательно промывают водой до полного удаления щелочи (проба на лакмусовую бумагу или фенолфталеин), отделяют водный слой, к эфирному экстракту добавляют 5-7 г свежепрокаленного сернокислого натрия и взбалтыванием колбы с содержимым высушивают вытяжку до полной прозрачности (в течение 15-20 мин).

Эфирную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр; колбу и фильтр ополаскивают небольшим количеством эфира, сливая последний через тот же фильтр, и отгоняют эфир на водяной бане в токе углекислого газа или азота до получения сухого остатка. Остаток растворяют в чистом сухом хлороформе в мерной колбе подходящего объема с таким расчетом, чтобы в 1 раствора содержалось не менее 200 и не более 1000 ин. ед. витамина Д..

Из полученного раствора отбирают точно 1 в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьми (отношение 1:6) и точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся окраски с указанным выше светофильтром.

В,качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.

Расчет содержания витамина Д в 1 концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле

где С - найденное по калибровочной кривой количество витамина Д в 1 раствора, ин. ед.;

V- разведение ;

m - навеска концентрата, г;

d - плотность концентрата.

При определении витамина Д в масляных растворах с содержанием до 10000 ин. ед. в 1 надо вносить поправку на вещества, содержащиеся в неомыляемой фракции рафинированного подсолнечного масла, дающие такую же, как витамин Д, окраску с треххлористой сурьмой. При вычислении содержания витамина Д в вышеуказанных масляных растворах уменьшают полученные данные на 25%.

23. Определение витамина Д в спиртовых концентратах

Высокоактивные спиртовые концентраты предварительно разбавляют спиртом с таким расчетом, чтобы в 1 содержалось не более 10000 ин. ед. витамина Д. Из разбавленного спиртового раствора отбирают пипеткой 1 помещают в небольшую колбу Вюрца и отгоняют растворитель на водяной бане досуха в токе углекислого газа или азота.

Полученный остаток растворяют в хлороформе и переносят в мерную колбу такого объема, чтобы в 1 раствора содержалось от 200 до 1000 ин. ед. витамина Д.

Из полученного раствора отбирают 1 , помещают в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьмы. Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся, окраски с указанным выше светофильтром.

В качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.

Расчет содержания витамина Д в 1 концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле.

где С - найденное по калибровочной кривой количество витамина Д в 1 раствора, ин. ед.;

V - разведение, ;

m - количество взятого на анализ концентрата, .

24. Применяемые реактивы

а) Тиаминхлорид-гидрохлорид 100%-ной чистоты с температурой плавления 246 - 250°С. Если нужно, его перекристаллизовывают 2 раза из 80%-ного этилового спирта, высушивают в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и хранят в эксикаторе, в темноте.

б) Красная кровяная соль. После перекристаллизации из дистиллированной воды из нее перед анализом приготовляют 1%-ный водный раствор.

в) Натр едкий х.ч. 30%-ный водный раствор; 15%-ный водный раствор.

г) Окислительная смесь: перед анализом смешивают 4 1%-ного раствора красной кровяной соли с 96 15%-ного раствора едкого натра.

д) Изобутиловый спирт с температурой кипения 107-108°С, изоамиловый спирт с температурой кипения 130°С или бутиловый-спирт с температурой кипения 117°С (употребляется любой из указанных спиртов).

е) Этиловый спирт, ректификованный 96%-ный.

Примечание. В случае наличия флуоресценции спирты перед употреблением подвергают очистке: к 1 спирта прибавляют 15-20 г активированного угля, встряхивают 15 мин, оставляют на сутки, повторяя несколько раз встряхивание. Декантируют, фильтруют, высушивают над хлористым кальцием и перегоняют при соответствующей температуре (перегонку изобутилового, изоамилового и бутилового спирта ведут на глицериновой или песчаной бане, а этилового - на водяной бане).

ж) Натрий сернокислый безводный, прокаленный.

з) Калий марганцевокислый, х.ч.

и) Серебро азотнокислое, 10%-ный раствор.

Все применяемые реактивы должны соответствовать требованиям действующих стандартов или технических условий.

25. Необходимая аппаратура

Флуороскоп: ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4, помещенная в кожух с черным никелевым светофильтром с набором пробирок одинакового диаметра из однородного нефлуоресцирующего стекла.

26. Описание определения

Флуороскопический визуальный метод

Приготовление шкалы стандартных растворов

100 мг чистого кристаллического тиаминхлорида-гидрохлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе, вместимостью 1 . Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой на холоду не более 1 мес. Из этого раствора приготовляют путем разведения стандартные рабочие растворы в мерных колбах вместимостью 100 по табл. 3.