1) Реакция на наличие свободного хлора в хлороформе: 10 хлороформа взбалтывают в 40 дистиллированной воды. Водный слой отделяют. 10 водного слоя не должны окрашиваться в синий цвет при добавлении 0,5 бесцветного 10%-ного раствора иодата калия и 0,5 раствора крахмала.

2) Реакция на содержание спирта: хлороформ, не содержащий спирта, не восстанавливает 0,1%-ный раствор перманганата калия (при проведении реакции дают постоять 15 мин.).

3) Реакция на содержание воды: при охлаждении до 3-4° 10 хлороформа не должны давать мути.

4) Реакция на содержание органических примесей: 15 хлороформа и 10 концентрированной серной кислоты помещают в склянку с притертой пробкой (склянка предварительно ополаскивается 2 раза хлороформом и 2 раза серной кислотой); после стояния в течение одного часа при 15°С в слое серной кислоты не должно появляться окрашивания.

б) Раствор треххлористой сурьмы. Продажную треххлористую сурьму промывают очищенным хлороформом, пока не будет стекать прозрачный и бесцветный раствор и высушивают в эксикаторе над серной кислотой в течение 1-2 сут в темноте. Насыщенный раствор треххлористой сурьмы в очищенном хлороформе приготовляют при 20°С.

в) Серный эфир. Очистка эфира от перекисей производится следующим образом: в склянку помещают 500 эфира, 50 4%-ного раствора , 5 40%-ного раствора NaOH или КОН, взбалтывают и оставляют на сутки в темноте. Смесь переносят в делительную воронку, нижний слой сливают, эфир промывают 5-6 раз дистиллированной водой (в отношении 2:1), высушивают в течение суток сернокислым натрием, перегоняют и сохраняют в темноте. Эфир необходимо проверять на отсутствие перекисей по качественной реакции с раствором иодистого калия.

г) Ацетилхлорид. Температура кипения 51°С. Сохранять в склянке или капельнице из темного стекла с притертой пробкой.

д) Спирт этиловый. Для освобождения спирта от альдегидов настаивают в течение 10-12 ч над твердым NaOH (5-10 г на 1 спирта) и перегоняют.

е) Натрий сернокислый кристаллический, безводный х.ч. или свежепрокаленный.

ж) Кали едкое, 10%-ный спиртовой раствор.

з) Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

и) Углекислый газ, полученный в аппарате Киппа или из баллона, или азот.

к) Иодистый калий, 10%-ный раствор.

Все применяемые реактивы должны соответствовать требованиям действующих стандартов или технических условий.

20. Необходимая аппаратура

Электроколориметр или штуфенфотометр.

21. Составление калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой применяют чистый, кристаллический кальциферол, растворенный в хлороформе, содержащий 10000 ин. ед. витамина Д в 10 (1 ин. ед. витамина Д соответствует 0,025 г чистого кальциферола). Хлороформенный раствор витамина Д хранится не более одного дня.

Измерение интенсивности окраски хлороформенного раствора кристаллического кальциферола с треххлористой сурьмой проводят в электрофотоколориметре со светофильтром 480-530 или штуфенфотометре.

Для проведения электрофотоколориметра к нулю пользуются хлороформенным раствором треххлористой сурьмы. Для получения точек калибровочной кривой берут 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 стандартного раствора витамина Д, доводят хлороформом до объема 1 , добавляют по 3 капли ацетилхлорида и 6 раствора треххлористой сурьмы. Отношение испытуемого раствора к раствору треххлористой сурьмы составляет 1:6.

Общий объем реакционной смеси должен составлять 7 .

Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют получаемые окраски и величины экстинкции откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина Д - по оси абсцисс.

В пределах содержания витамина Д от 200 до 1000 ин. ед. в 1 на графике получается прямая линия.

22. Определение витамина Д в масляных концентратах с омылением

Навеску концентрата, в количестве 0,5-2 г, в зависимости от содержания витамина Д, взятую на аналитических весах, помещают в колбу, снабженную обратным холодильником, и подвергают омылению на водяной бане при помощи 10 10%-ного спиртового раствора КОН в течение 1 ч при температуре кипения спирта.

По охлаждении смеси к ней добавляют двойной объем дистиллированной воды, переносят в делительную воронку, смывают из колбы небольшими порциями воды и неомыляемую фракцию извлекают трижды серным эфиром, свободным от перекиси, используя первый раз 50 , второй и третий раз по 25 эфира.

Объединенные эфирные вытяжки тщательно промывают водой до полного удаления щелочи (проба на лакмусовую бумагу или фенолфталеин), отделяют водный слой, к эфирному экстракту добавляют 5-7 г свежепрокаленного сернокислого натрия и взбалтыванием колбы с содержимым высушивают вытяжку до полной прозрачности (в течение 15-20 мин).

Эфирную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр; колбу и фильтр ополаскивают небольшим количеством эфира, сливая последний через тот же фильтр, и отгоняют эфир на водяной бане в токе углекислого газа или азота до получения сухого остатка. Остаток растворяют в чистом сухом хлороформе в мерной колбе подходящего объема с таким расчетом, чтобы в 1 раствора содержалось не менее 200 и не более 1000 ин. ед. витамина Д..

Из полученного раствора отбирают точно 1 в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьми (отношение 1:6) и точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся окраски с указанным выше светофильтром.

В,качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.

Расчет содержания витамина Д в 1 концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле

где С - найденное по калибровочной кривой количество витамина Д в 1 раствора, ин. ед.;

V- разведение ;

m - навеска концентрата, г;

d - плотность концентрата.

При определении витамина Д в масляных растворах с содержанием до 10000 ин. ед. в 1 надо вносить поправку на вещества, содержащиеся в неомыляемой фракции рафинированного подсолнечного масла, дающие такую же, как витамин Д, окраску с треххлористой сурьмой. При вычислении содержания витамина Д в вышеуказанных масляных растворах уменьшают полученные данные на 25%.

23. Определение витамина Д в спиртовых концентратах

Высокоактивные спиртовые концентраты предварительно разбавляют спиртом с таким расчетом, чтобы в 1 содержалось не более 10000 ин. ед. витамина Д. Из разбавленного спиртового раствора отбирают пипеткой 1 помещают в небольшую колбу Вюрца и отгоняют растворитель на водяной бане досуха в токе углекислого газа или азота.

Полученный остаток растворяют в хлороформе и переносят в мерную колбу такого объема, чтобы в 1 раствора содержалось от 200 до 1000 ин. ед. витамина Д.

Из полученного раствора отбирают 1 , помещают в кювету электрофотоколориметра или штуфенфотометра, туда же добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 хлороформенного раствора треххлористой сурьмы. Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся, окраски с указанным выше светофильтром.

В качестве контроля для установки прибора на нуль используют раствор, состоящий из 1 хлороформа, 6 раствора треххлористой сурьмы и 3 капель ацетилхлорида.

Расчет содержания витамина Д в 1 концентрата (X) в ин. ед. производят по формуле.

где С - найденное по калибровочной кривой количество витамина Д в 1 раствора, ин. ед.;

V - разведение, ;

m - количество взятого на анализ концентрата, .

24. Применяемые реактивы

а) Тиаминхлорид-гидрохлорид 100%-ной чистоты с температурой плавления 246 - 250°С. Если нужно, его перекристаллизовывают 2 раза из 80%-ного этилового спирта, высушивают в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и хранят в эксикаторе, в темноте.