а) Жидкие продуты (обогащенный витамином рыбий жир, препараты витамина в масле и в спирте). Среднюю пробу жидких продуктов разводят в растительном масле, не содержащем витамин (в подсолнечном масле). Для первого разведения берут пипеткой не менее 0,5 . Из первого разведения приготовляют путем дальнейшего разведения раствора, предназначенные для непосредственного скармливания крысам.

б) Твердые штучные изделия (драже с витамином Д, поливитаминное драже и т.д.).

Из средней пробы берут для анализа навеску на технохимических весах в количестве 20 г для поливитаминного драже, 15 г для граммового драже и 5 г мелкого драже.

Из навески извлекают витамин Д с помощью серного эфира, используя для этого 1-й раз - 100 , 2-й, 3-й и 4-й раз - по 50 эфира, после чего эфир отгоняют в токе углекислоты. Сухой остаток растворяют в подсолнечном масле.

Из полученного Д-витаминного раствора приготовляют соответствующие растворы, согласно выбранным рабочим дозам.

Разводки хранят в леднике в склянках, закрытых пробками. Каждую склянку снабжают этикеткой с указанием скармливаемой дозы исследуемого препарата.

16. Подготовка крыс

а) Опыты проводятся на белых крысах массой 40-50 г; крысы каждой семьи по возможности равномерно распределяются по группам в количестве не менее 10 в каждой группе.

б) Каждую крысу взвешивают при поступлении на опыт и на 16-й день опыта; при анализе результатов взвешиваний исключаются животные, потерявшие в течение опыта в массе.

в) Каждую крысу метят путем окрашивания различных участков тела.

г) В течение опыта все крысы получают один из следующих рационов:

Рацион N 1	в процентах
Пшеничная мука 30 или 72% ...........................	90
Сухие пивные или пекарские дрожжи ...........................	5
Очищенный мел ...........................	3
Пищевая соль ...........................	2
Рацион N 2	в процентах
Пшеничная мука 30 или 72% ...........................	50
Овсяная мука ...........................	45
Очищенный мел ...........................	4
Пищевая соль ...........................	1

Составные части рациона тщательно смешивают с водой, из смеси выпекают хлеб; каждая крыса получает примерно по 20 г хлеба в день.

д) Стандартным раствором витамина Д в опытах служит раствор кальциферола в подсолнечном масле, проверенный по международному эталону.

е) Испытуемые и эталонные растворы приготовляются в четырех разведениях из расчета 3 - 6 - 9 - 12 ин. ед. в 0,05 (или в 0,1 ) и скармливаются в этих дозах крысам на 1-й и 8-й день опыта.

ж) Для скармливания животным испытуемого и эталонного растворов применяют пипетку длиной 8 - 10 см, в которую насасывают масло и выпускают посредством находящегося на одном конце небольшого резинового баллона. Пипетку в зависимости от скармливаемой суточной дозы калибруют на 0,05 или 0,1 весовым путем.

17. Методы определения степени рахита

а) Рентгенографический метод. Производят рентгенографическую съемку задних конечностей живых или убитых крыс; конечности при этом необходимо несколько вытягивать. Степень рахита определяют по ширине хрящевой зоны метафизов большеберцовых костей.

б) Проба на черту. При отсутствии рентгеновской установки у убитых крыс вырезают большеберцовые кости, которые после очистки от мышц помещают в 4%-ный раствор формалина на 18-24 ч. Промыв кости в течение 5-10 мин водой, их рассекают продольно по медиальной линии при помощи острого лезвия и погружают в 0,5%-ный раствор азотнокислого серебра. После этого кости выставляют на свет (солнечный или яркой электролампы) на 10-20 мин и, как только появится на поверхности разреза серая окраска средней интенсивности, быстро промывают водой и переносят в 5%-ный раствор гипосульфита на 10-15 мин; вновь быстро промывают водой. На поверхности разреза в области зоны эпифизарного окостенения на темном фоне костной ткани резко выделяется светлая полоса хряща. Степень рахита определяют по ширине этой хрящевой зоны при помощи бинокулярной лупы с рисовальным аппаратом Аббе. С каждой кости на отдельную карточку зарисовывают карандашом контуры хрящевой зоны верхнего эпифиза и производят оценку степени рахита.

18. Определение минимальной профилактической дозы. Под минимальной профилактической дозой как исследуемой пробы, так и эталона витамина Д понимается минимальное количество препарата, предохраняющее от рахита не менее 80% крыс данной группы.

Определив, какая доза исследуемой пробы эталона витамина Д соответствует минимальной профилактической, вычисляют содержание витамина Д в ин. ед. (X) в 1 (или 1 г) исследуемой пробы по следующей формуле

где а - минимальная профилактическая доза исследуемой пробы, или г;

b - минимальная профилактическая доза эталона витамина Д в ин. ед.

V. Метод определения витамина Д
(Химический метод)

19. Применяемые реактивы

а) Хлороформ химически чистый, не содержащий примесей. Хлороформ промывают три-четыре раза дистиллированной водой, отделяют от воды, высушивают свежепрокаленным сернокислым натром или хлористым кальцием в течение суток и отгоняют на водяной бане при температуре 61°. Хранить в склянках темного стекла с притертой пробкой не более 1 мес.

Хлороформ подвергают испытанию на его пригодность для анализа при помощи следующих реакций:

1) Реакция на наличие свободного хлора в хлороформе: 10 хлороформа взбалтывают в 40 дистиллированной воды. Водный слой отделяют. 10 водного слоя не должны окрашиваться в синий цвет при добавлении 0,5 бесцветного 10%-ного раствора иодата калия и 0,5 раствора крахмала.

2) Реакция на содержание спирта: хлороформ, не содержащий спирта, не восстанавливает 0,1%-ный раствор перманганата калия (при проведении реакции дают постоять 15 мин.).

3) Реакция на содержание воды: при охлаждении до 3-4° 10 хлороформа не должны давать мути.

4) Реакция на содержание органических примесей: 15 хлороформа и 10 концентрированной серной кислоты помещают в склянку с притертой пробкой (склянка предварительно ополаскивается 2 раза хлороформом и 2 раза серной кислотой); после стояния в течение одного часа при 15°С в слое серной кислоты не должно появляться окрашивания.

б) Раствор треххлористой сурьмы. Продажную треххлористую сурьму промывают очищенным хлороформом, пока не будет стекать прозрачный и бесцветный раствор и высушивают в эксикаторе над серной кислотой в течение 1-2 сут в темноте. Насыщенный раствор треххлористой сурьмы в очищенном хлороформе приготовляют при 20°С.

в) Серный эфир. Очистка эфира от перекисей производится следующим образом: в склянку помещают 500 эфира, 50 4%-ного раствора , 5 40%-ного раствора NaOH или КОН, взбалтывают и оставляют на сутки в темноте. Смесь переносят в делительную воронку, нижний слой сливают, эфир промывают 5-6 раз дистиллированной водой (в отношении 2:1), высушивают в течение суток сернокислым натрием, перегоняют и сохраняют в темноте. Эфир необходимо проверять на отсутствие перекисей по качественной реакции с раствором иодистого калия.

г) Ацетилхлорид. Температура кипения 51°С. Сохранять в склянке или капельнице из темного стекла с притертой пробкой.

д) Спирт этиловый. Для освобождения спирта от альдегидов настаивают в течение 10-12 ч над твердым NaOH (5-10 г на 1 спирта) и перегоняют.

е) Натрий сернокислый кристаллический, безводный х.ч. или свежепрокаленный.

ж) Кали едкое, 10%-ный спиртовой раствор.

з) Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

и) Углекислый газ, полученный в аппарате Киппа или из баллона, или азот.

к) Иодистый калий, 10%-ный раствор.

Все применяемые реактивы должны соответствовать требованиям действующих стандартов или технических условий.

20. Необходимая аппаратура

Электроколориметр или штуфенфотометр.

21. Составление калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой применяют чистый, кристаллический кальциферол, растворенный в хлороформе, содержащий 10000 ин. ед. витамина Д в 10 (1 ин. ед. витамина Д соответствует 0,025 г чистого кальциферола). Хлороформенный раствор витамина Д хранится не более одного дня.

Измерение интенсивности окраски хлороформенного раствора кристаллического кальциферола с треххлористой сурьмой проводят в электрофотоколориметре со светофильтром 480-530 или штуфенфотометре.

Для проведения электрофотоколориметра к нулю пользуются хлороформенным раствором треххлористой сурьмы. Для получения точек калибровочной кривой берут 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 стандартного раствора витамина Д, доводят хлороформом до объема 1 , добавляют по 3 капли ацетилхлорида и 6 раствора треххлористой сурьмы. Отношение испытуемого раствора к раствору треххлористой сурьмы составляет 1:6.

Общий объем реакционной смеси должен составлять 7 .

Точно через 4 мин после добавления последнего реактива измеряют получаемые окраски и величины экстинкции откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина Д - по оси абсцисс.