Примечания:

1. В случае анализа незрелых плодов шиповника вместо воды для экстракции применяют 2%-ную соляную кислот)

2. При анализе плодов шиповника контрольными методами употребляют не 300 воды, а вдвое меньше.

р) При анализе молока 5 молока разводят в 3 раза дистиллированной водой (1:2). При разведении молоко отмеривают пипеткой, а дистиллированную воду наливают из бюретки вместимостью 25-50 . 5 полученного раствора вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 25-50 , куда заранее наливают 1 2%-ной соляной кислоты и дистиллированной воды до общего объема в 15 ; затем, осторожно взбалтывая, содержимое колбы титруют из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, приливая последний каплями до появления слаборозового окрашивания, удерживающегося 0,5-1 мин. Для повторного титрования отбирают пробу из той же порции разведенного молока.

Примечания:

1. Молозиво разводят в 3-6 раз

2. В случае необходимости хранения молоко должно быть помещено в склянку темного стекла, закрытую пробкой

с) Содержание аскорбиновой кислоты (витамина С) (Х), мг%, вычисляют по формуле

где обозначения те же, что и в п. 14к настоящего стандарта.

Иодатный метод

т) Экстракцию витамина С из навески производят по методу, указанному в п. 14а, б и в настоящего стандарта, с заменой уксусной кислоты раствором 2%-ной соляной кислоты.

В случаях анализа продуктов твердой или густой консистенции из центрифугата или фильтрата солянокислых экстрактов отбирают 1-5 , в зависимости от содержания витамина С, определяемого первым титрованием, вносят в коническую колбу емкостью 50-100 , куда заранее налито 0,5 1%-ного раствора иодистого калия, 2 0,5%-ного раствора крахмала и столько воды, чтобы общий объем жидкости равнялся 10 ; затем титруют из микробюретки 0,001 н раствором иодноватокислого калия до появления стойкого слабосинего окрашивания.

Жидкие пробы разводят непосредственно перед титрованием соляной кислотой или водой или титруют без разведения; в последних случаях титрование производят в присутствии 1 2%-ной соляной кислоты.

Поправка на реактивы (контрольный опыт) производится следующим образом: в коническую колбу наливают 0,5 1%-ного раствора иодистого калия, 2 0,5%-ного раствора крахмала, 1 2%-ной НСl и столько воды, чтобы общий объем равнялся 10 и титруют 0,001 н,раствором до появления слабосинего окрашивания.

Допускается также применение при титровании 0,01 н раствора иодноватокислого калия.

у) Содержание аскорбиновой кислоты (витамина С) (X), мг%, вычисляют по формуле

где - количество 0,001 н раствора иодноватокислого калия, используемое на титрование, за вычетом поправки на реактивы, ;

- объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней экстрагирующей жидкости, ;

- количество экстракта, взятое для титрования, ;

F - поправка на титр иодноватокислого калия для перевода его на 0,001 н раствор, равная 1 при употреблении точно 0,001 н раствора;

m - навеска, г или объем, ;

0,088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 точно 0,001 н раствора иодноватокислого калия, мг.

IV. Методы определения витамина Д
(Биологический метод)

15. Предварительная обработка исследуемого объекта

а) Жидкие продуты (обогащенный витамином рыбий жир, препараты витамина в масле и в спирте). Среднюю пробу жидких продуктов разводят в растительном масле, не содержащем витамин (в подсолнечном масле). Для первого разведения берут пипеткой не менее 0,5 . Из первого разведения приготовляют путем дальнейшего разведения раствора, предназначенные для непосредственного скармливания крысам.

б) Твердые штучные изделия (драже с витамином Д, поливитаминное драже и т.д.).

Из средней пробы берут для анализа навеску на технохимических весах в количестве 20 г для поливитаминного драже, 15 г для граммового драже и 5 г мелкого драже.

Из навески извлекают витамин Д с помощью серного эфира, используя для этого 1-й раз - 100 , 2-й, 3-й и 4-й раз - по 50 эфира, после чего эфир отгоняют в токе углекислоты. Сухой остаток растворяют в подсолнечном масле.

Из полученного Д-витаминного раствора приготовляют соответствующие растворы, согласно выбранным рабочим дозам.

Разводки хранят в леднике в склянках, закрытых пробками. Каждую склянку снабжают этикеткой с указанием скармливаемой дозы исследуемого препарата.

16. Подготовка крыс

а) Опыты проводятся на белых крысах массой 40-50 г; крысы каждой семьи по возможности равномерно распределяются по группам в количестве не менее 10 в каждой группе.

б) Каждую крысу взвешивают при поступлении на опыт и на 16-й день опыта; при анализе результатов взвешиваний исключаются животные, потерявшие в течение опыта в массе.

в) Каждую крысу метят путем окрашивания различных участков тела.

г) В течение опыта все крысы получают один из следующих рационов:

Рацион N 1	в процентах
Пшеничная мука 30 или 72% ...........................	90
Сухие пивные или пекарские дрожжи ...........................	5
Очищенный мел ...........................	3
Пищевая соль ...........................	2
Рацион N 2	в процентах
Пшеничная мука 30 или 72% ...........................	50
Овсяная мука ...........................	45
Очищенный мел ...........................	4
Пищевая соль ...........................	1

Составные части рациона тщательно смешивают с водой, из смеси выпекают хлеб; каждая крыса получает примерно по 20 г хлеба в день.

д) Стандартным раствором витамина Д в опытах служит раствор кальциферола в подсолнечном масле, проверенный по международному эталону.

е) Испытуемые и эталонные растворы приготовляются в четырех разведениях из расчета 3 - 6 - 9 - 12 ин. ед. в 0,05 (или в 0,1 ) и скармливаются в этих дозах крысам на 1-й и 8-й день опыта.

ж) Для скармливания животным испытуемого и эталонного растворов применяют пипетку длиной 8 - 10 см, в которую насасывают масло и выпускают посредством находящегося на одном конце небольшого резинового баллона. Пипетку в зависимости от скармливаемой суточной дозы калибруют на 0,05 или 0,1 весовым путем.

17. Методы определения степени рахита

а) Рентгенографический метод. Производят рентгенографическую съемку задних конечностей живых или убитых крыс; конечности при этом необходимо несколько вытягивать. Степень рахита определяют по ширине хрящевой зоны метафизов большеберцовых костей.

б) Проба на черту. При отсутствии рентгеновской установки у убитых крыс вырезают большеберцовые кости, которые после очистки от мышц помещают в 4%-ный раствор формалина на 18-24 ч. Промыв кости в течение 5-10 мин водой, их рассекают продольно по медиальной линии при помощи острого лезвия и погружают в 0,5%-ный раствор азотнокислого серебра. После этого кости выставляют на свет (солнечный или яркой электролампы) на 10-20 мин и, как только появится на поверхности разреза серая окраска средней интенсивности, быстро промывают водой и переносят в 5%-ный раствор гипосульфита на 10-15 мин; вновь быстро промывают водой. На поверхности разреза в области зоны эпифизарного окостенения на темном фоне костной ткани резко выделяется светлая полоса хряща. Степень рахита определяют по ширине этой хрящевой зоны при помощи бинокулярной лупы с рисовальным аппаратом Аббе. С каждой кости на отдельную карточку зарисовывают карандашом контуры хрящевой зоны верхнего эпифиза и производят оценку степени рахита.

18. Определение минимальной профилактической дозы. Под минимальной профилактической дозой как исследуемой пробы, так и эталона витамина Д понимается минимальное количество препарата, предохраняющее от рахита не менее 80% крыс данной группы.

Определив, какая доза исследуемой пробы эталона витамина Д соответствует минимальной профилактической, вычисляют содержание витамина Д в ин. ед. (X) в 1 (или 1 г) исследуемой пробы по следующей формуле

где а - минимальная профилактическая доза исследуемой пробы, или г;

b - минимальная профилактическая доза эталона витамина Д в ин. ед.