ГОСТ 9.052-88 ЕСЗКС. Масла и смазки. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов

Принявший орган: Госстандарт СССР

Дата введения 01.01.89

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством высшего и среднего специального образования СССР

ИСПОЛНИТЕЛИ

А.А. Гуреев, д-р техн. наук; Е.Г. Торопова, д-р биолог, наук; Н.Н. Угарова, д-р хим. наук; Е.А. Иозеп, канд. техн. наук; А.А. Байгожин, д-р хим. наук; А.А. Герасименко, д-р техн. наук; З.С. Боголюбова (руководители темы);И.А. Тимохин, канд. хим. наук; Н.В. Зубкова, канд. техн. наук; Л.Ю. Бровко, канд. хим. наук; Б.А. Чепенко, канд. техн. наук; А.А. Самунина, канд. биолог, наук; Г.В. Матюша, А.И. Солонович, Л.В. Березниковская.

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25.03.88 № 754

3. Срок первой проверки - 1993 г.

4. ВЗАМЕН ГОСТ 9.052-75

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка
Номер пункта, подпункта, приложения
ГОСТ 9.048-89
1.3.3, 1.4, 1.5.1, 1.5.2, 1.5.3, 1.6.1, 2.4, 2.6.1, 3.4, 3.6.1, 4.4, приложение
ГОСТ 61-75
Приложение
колбы, пробирки. Технические условия">ГОСТ 1770-74
»
ГОСТ 2517-85
1.2.1
ГОСТ 4523-77
Приложение
ГОСТ 6709-72
»
ГОСТ 10652-73
»
ГОСТ 16317-87
»
ГОСТ 25336-82
»
ГОСТ 29169-91
»
ГОСТ 29329-92
»

6. Ограничение срока действия снято по решению Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 5-6-93)

7. Переиздание. Сентябрь 1995 г.

Настоящий стандарт распространяется на масла и смазки и устанавливает методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов:

1 - для установления грибостойкости масел и смазок при отсутствии минеральных и органических загрязнений;

2 - для установления грибостойкости смазок в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;

3 - для установления грибостойкости масел в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;

4 - для установления грибостойкости масел и смазок в условиях, имитирующих минеральные и органические загрязнения.

Смазки, применяемые для оптических приборов, испытывают только методом 1.

Методы применяют при испытании масел и смазок, к которым в стандартах или технических условиях предъявляют требования грибостойкости.

1. МЕТОД 1

1.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов зараженных водной суспензией спор грибов, в условиях оптимальных для развития грибов, без дополнительного источника минерального и органического питания.

mso-bidi-font-family:Arial'>1.2. Отбор образцов

1.2.1. Масла и смазки отбирают по ГОСТ 2517-85 массой 10 - 15 г.

1.2.2. Образцами являются масла и смазки в состоянии поставки, без специальной очистки и стерилизации.

1.2.3. Количество параллельных образцов должно быть не менее пяти.

Aspergillus niger van Tieghem

Penicillium chrysogenum Thorn

Penicillium cyclopium Westling

Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier

Paecilomyces varioti Bainier

1.3.2. Культуры грибов получают в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, поддерживают периодическим пересевом и выращивают непосредственно перед испытаниями.

выращивание и хранение культур грибов - по ГОСТ 9.048-89.

материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048-89.

1.5. Подготовка к испытаниям

1.5.1. Посуду и материалы готовят по ГОСТ 9.048-89.

1.5.2. Среды для выращивания, хранения культур грибов и для испытаний готовят по ГОСТ 9.048-89.

Рецептура сред приведена в таблице.

Наименование реактива
Среда 1 (Чапека-Докса с агаром)
Среда 2 (Чапека-Докса с агаром без сахарозы)
Среда 3 (выщелоченный агар)
Среда 4 (сусло-агар)
Среда 5 (минеральная без сахарозы)
Однозамещенный фосфорнокислый калий, г
0,7
0,7
-
-
1,0
Двузамещенный фосфорнокислый калий, г
0,3
0,3
-
-
-
Сернокислый магний, г
0,5
0,5
-
-
0,5
Азотнокислый натрий, г
2,0
2,0
-
-
3,0
Хлористый калий, г
0,5
0,5
-
 
2,0
Сернокислое железо, г
0,01
0,01
-
-
-
Сахароза, г
30,0
-
-
-
-
Агар-агар, г
30,0
Выщелоченный 30,0
Выщелоченный 30,0
30,0
-
Четырехбаллинговое неохмеленное пивное сусло (4 % сахара), см3
-
-
-
До 1000
-
Дистиллированная вода, см3
До 1000
-
-
Водопроводная вода, см3
-
-
-
-
До 1000

1.5.3. Чистые культуры грибов пересевают и выращивают по ГОСТ 9.048-89, используя грибы, приведенные в п.1.3.1

Образцы смазок наносят на предметные стекла, покрывая всю поверхность слоем 1,5-2,0 мм, и помещают в чашки Петри.

1.5.5. Контроль жизнеспособности спор грибов проводят по ГОСТ 9.048-89.

Для контроля жизнеспособности спор грибов в чашку Петри наливают среду 1 или 4 в количестве 20-30 см3 и дают ей застыть

1.6. Проведение испытаний

1.6.1. Водную суспензию спор грибов готовят по ГОСТ 9.048-89, используя грибы, выращенные, как указано в п. 1.5.3.

не допуская слияния капель.

1.6.3. Образцы масел и смазок после заражения выдерживают 1-2 ч при температуре (25 ± 10) °С.

на дно которого налита вода. Эксикатор устанавливают в термостат с температурой (29 ± 2) С.

1.6.5. Образцы выдерживают в термостате 56 сут.

споры грибов считают нежизнеспособными. Испытания прекращают и повторяют их на новых образцах с вновь приготовленной суспензией спор из новой партии грибов.

1.6.7. Через 28 сут производят промежуточный осмотр образцов. Испытания образцов, на которых обнаруживают развитие грибов, прекращают.

1.7. Обработка результатов

2. МЕТОД 2

2.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.

2.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

2.3. Виды грибов - по п. 1.3.

материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048-89.

2.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1-1.5.3, 1.5.5.

2.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048-89.

2.6.2. Смазки наносят скальпелем в количестве пяти образцов размером 10×10 мм толщиной 1,5-2,0 мм на поверхность среды в чашку Петри, подготовленную, как указано в п. 2.5.1.

2.6.3. Дальнейший порядок проведения испытаний соответствует требованиям пп. 1.6.2-1.6.4.

2.6.4. Образцы выдерживают в течение 28 сут.

2.6.5. Дальнейший порядок проведения испытаний - по пп. 1.6.6-1.6.8 с промежуточным осмотром образцов через 14 сут.

2.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1, 1.7.2.

3. МЕТОД 3

3.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.

3.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

3.3. Виды грибов - по п. 1.3.

материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048-89.

3.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 -1.5.3 и 1.5.5.

3.5.2. Контролем служит суспензия спор грибов в среде 5.

3.6. Проведение испытаний.

3.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048-89.

3.6.2. Образцы масел в количестве 2 см3 вносят не менее чем в пять пробирок, приготовленных, как указано в п.3.5.1.

3.6.3. Пробирки помещают в наклонном положении под углом 30° и выдерживают в термостате при температуре (29 ± 2) °С.

3.6.4. Пробирки с образцами выдерживают в термостате 10 сут.

При появлении признаков развития грибов в образцах испытания прекращают.

3.6.6. По окончании испытаний пробирки с образцами извлекают из термостата и осматривают невооруженным глазом или с помощью лупы при 2,5-5,0-кратном увеличении.

3.7. Обработка результатов.

3.7.1. Масла считаются грибостойкими, если отсутствует развитие грибов на всех испытанных образцах (отсутствует пленка на границе раздела среда - масло, в пробирках среда прозрачна и не пигментирована, нет осадка).

3.7.2. Масла считаются не стойкими к плесневым грибам, если на образцах наблюдается развитие грибов, признаком которого служит образование пленки на границе раздела среда - масло, помутнение и пигментация среды, образование осадка.

3.7.3. Допускается оценивать грибостойкость масел биолюминесцентным методом, приведенным в приложении.

4. МЕТОД 4

4.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального и органического питания.

4.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

4.3. Виды грибов - по п. 1.3.

материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048-89.

4.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 -1.5.3, 1.5.5.

4.5.1. Для размещения образцов смазок готовят чашки Петри, как указано в п. 2.5.1, используя среду 1 или 4.

4.5.2. Для размещения образцов масел готовят лунки, как указано в п. 1.5.4, используя среду 1 или 4.

4.6. Проведение испытаний - по п. 2.6.

4.6.1. Образцы выдерживают в термостате в условиях, приведенных в п. 1.6.4, 14 сут.

4.6.2. Промежуточный осмотр образцов производят через 7 сут после начала испытаний.

4.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1. и 1.7.2.

5. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ - по ГОСТ 9.048-89.

ПРИЛОЖЕНИЕ Обязательное. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ГРИБОСТОЙКОСТИ

Сущность метода заключается в определении количества внутриклеточной аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п. 3.6.5) с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с использованием люциферин-люци-феразной системы светляков. Интенсивность излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах живых клеток примерно одинаково и составляет 1 -10 мг/г сухого веса. Этот факт является основой биолюминесцентного метода определения биомассы.

1. материалы и реактивы

Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000, предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области спектра 400-600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 104 до 108 квант/с.

Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329-92.

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 С.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317-87.

Дозатор для отбора проб 0,1 см3.

Лабораторный рН-метр.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336-82.

Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см3 по колбы, пробирки. Технические условия">ГОСТ 1770-74.

Пипетки вместимостью 1, 10 см3 по ГОСТ 29169-91.

Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).

Люцифераза светляков.

Люциферин

Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.

Трис- (оксиметил) - аминометан, х.ч.

Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61-75.

Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523-77.

Соль динатриевая этилендиамин - N, N, N´, N΄ - тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ 10652-73.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

2. Подготовка к испытаниям

2.1. Стерилизуют посуду по ГОСТ 9.048-89.

доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм3 разливают на порции объемом 1 см3 и хранят при температуре минус 20 С. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 месяцев.

порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм3 (по п. 2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см3 раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см3 дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм3 готовят непосредственно перед применением.

2.4. Готовят 20 %-ный раствор уксусной кислоты: 10 см3 уксусной кислоты разбавляют 40 см3 дистиллированной воды.

в мерную колбу вместимостью 50 см3 загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в стакан вместимостью 100 см3 и титруют 20 %-ным раствором уксусной кислоты до рН-7,8.

2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатном буферном растворе (п. 2.5). Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.

2.7. Готовят раствор люциферина: 3 мг люциферина растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатного буферного раствора (п. 2.5).

2.8. Готовят экстракт клеток: отбирают из пробирок с образцами после выдержки их в термостате 3 и 5 сут (п. 3.6.5) пробу минеральной среды объемом 0,1 см3 и добавляют ее в пробирку к 0,9 см3 диметилсульфоксида (ДМСО). Смесь перемешивают встряхиванием в течение 1-2 мин. Экстракт пригоден для анализа в течение 1 сут.

3. Проведение испытаний

3.1. Помещают в кювету люминометра с помощью дозатора последовательно 0,1 см3 раствора люциферина, 0,1 см3раствора люциферазы, 0,7 см3 трис-ацетатного буферного раствора и регистрируют интенсивность фонового свечения Iфон в милливольтах.

3.2. Добавляют в ту же кювету дозатором 0,1 см3 экстракта клеток (п. 2.8), перемешивают и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I1.

3.3. Добавляют в ту же кювету 0,02 см3 стандартного раствора АТФ (п. 2.3) и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I2.

4. Обработка результатов

4.1. Интенсивность люминесценции образца (Iобр) в милливольтах вычисляют по формуле

                                                                (1)

4.2. Интенсивность люминесценции стандартного раствора АТФ (Iст) милливольтах вычисляют по формуле

                                                                    (2)

4.3. Концентрации АТФ [АТФ]обр в микромолях в образце вычисляют по формуле

                                                (3)

где V - объем экстракта клеток, равный 0,1 см3;

V1 - объем реакционной смеси до добавления стандартного раствора АТФ, равный 1 см3;

V2 - объем реакционной смеси после добавления стандартного раствора АТФ, равный 1,02 см3;

Vст - объем добавленного стандартного раствора АТФ, равный 0,02 см3;

[АТФ]ст - концентрация АТФ в стандартном растворе, равная 10 мкмоль;

10 - коэффициент, учитывающий разбавление пробы образца при экстракции клеток диметилсульфоксидом в 10 раз.

При упрощении формула (3) приобретает вид:

4.4. Масла являются грибостойкими, если концентрация АТФ меньше или равна 10-7 моль, масла не грибостойки, если концентрация АТФ в образцах больше 10-7 моль.

___________________________________________